O PCR (Reação em cadeia da polimerase) permite a replicação dos genes, isto é, a obtenção in vitrio de milhões de cópias idênticas de uma certa região do DNA, a partir de uma região de DNA molde. Para tal, é necessária a utilização da Taq polimerase, uma DNApolimerase termoestável proveniente de uma bactéria termofílica (Thermus aquaticus, que vive a uma temperatura ótima de 70ºC). Esta enzima termoestável é fundamental, uma vez que as DNApolimerases do ser humano não funcionam a altas temperaturas, necessárias para a desnaturação e quebra da dupla hélice de DNA.
Esta técnica muito útil para análises genética, como na ciência forense.
O procedimento do PCR baseia-se num ciclo com 3 temperaturas diferentes para separar as cadeias de DNA e duplicar o material genético:
- Extrai-se o segmento de DNA da amostra.
- Eleva-se a temperatura a 90ºC, para separar completamente a cadeia dupla de DNA em duas cadeias simples;
- Reduz-se a temperatura para os 55ºC , de forma a que os primers (fragmentos curtos de DNA sintético) se liguem ao seu DNA complementar (que corresponde à região do DNA-amostra que se pretende replicar.)
- Eleva-se a temperatura até aos 72ºC para que a Taq polimerase comece a adicionar nucleótidos ao fragmento de DNA (primer) pré-existente, até ser restabelecida a cadeia dupla.
Este ciclo (etapa 2, 3 e 4) repete-se 25 a 30 vezes e demora cerca de 2 a 3 horas, dependendo do tamanho do fragmento de DNA a replicar. No final da técnica, têm-se milhões de cópias do fragmento. Na teoria, o DNA aumentaria 225 vezes. Todavia, na prática a amplificação não é tão eficiente, resultando num aumento de 1 milhão de vezes.
Normalmente, o resultado do PCR é confirmado pela eletroforese em gel, onde os fragmentos de DNA irão migrar do pólo negativo para o pólo positivo (uma vez que o DNA é rico em cargas negativas, devido aos grupos fosfato), sendo separados consoante o seu tamanho molecular. Quanto menor for o fragmento, mais célere será a sua migração. Fragmentos de DNA com o mesmo comprimento (por exemplo, 2 fragmentos com 300 pares de bases) migrarão a mesma distância no gel.
Desta forma, através de um DNA ladder (cujos fragmentos de DNA são de tamanho conhecido) é possível determinar de que tamanho é o fragmento de DNA em estudo. Claro que, sendo o DNA microscópico, apenas a existência de muitos fragmentos idênticos será visível (daí ser necessário o PCR):
Para além da eletroforese em gel, o produto de PCR pode ainda ser utilizado para a sequenciação, testes genéticos, diagnósticos, entre outros.
Exercício: Com base no resultado da eletroforese da mãe e do pai, qual destas crianças é o filho do casal?
Para ver a resposta, sublinhar com o rato o espaço seguinte: A criança 1, uma vez que só ela tem as mesmas bandas que o pai e a mãe. As crianças 1 e 3 não são filhas do casal, pois têm bandas que não existem na eletroforese da mãe e do pai.
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